標記大腸桿菌

微生物細胞表面表達的蛋白質(zhì)可用于各種應用并對其進(jìn)行操作。它們已被證明在廣泛的領(lǐng)域非常有用，包括蛋白質(zhì)工程、抗體片段篩選、全細胞催化劑、生物修復吸附劑等 。然而，一個(gè)主要的限制是只有 20 種天然存在的氨基酸。如果可以擴展表達的氨基酸組或用合成衍生物專(zhuān)門(mén)替換某些氨基酸，則可以進(jìn)一步操縱表面蛋白，潛在應用的數量將呈指數增加。在這個(gè)方向上，一些研究小組已經(jīng)取得了顯著(zhù)的成功。

利用 HDC 反應的高可靠性，Link 和 Tirrell 將一種含疊氮化物的合成氨基酸摻入大腸桿菌的表面蛋白質(zhì)中 。他們選擇的氨基酸是疊氮高丙氨酸 (AHA)。之前已經(jīng)表明 AHA 可以替代蛋白質(zhì)中的甲硫氨酸殘基  并且大腸桿菌的外膜蛋白 C (OmpC) 包含三個(gè)這樣的殘基。還創(chuàng )建了每個(gè) OmpC 含有九個(gè)甲硫氨酸殘基的突變大腸桿菌用于比較。一旦 AHA 被納入 OmpC 中，使用生物素化炔試劑進(jìn)行點(diǎn)擊反應。兩種細胞都被成功地生物素化，但只有突變的大腸桿菌會(huì )與大分子抗生物素蛋白結合，這可能是由于額外的甲硫氨酸殘基周?chē)目臻g擁擠較少。

標記 DNA

寡核苷酸代表了一類(lèi)非常重要的生物分子。盡管過(guò)去由于缺乏知識，它們一直被制藥界“回避"，但它們最近發(fā)現了許多應用，并被認為是許多研究領(lǐng)域最重要的工具。它們已被用于基因治療、作為治療白血病等疾病的反義劑、作為分子探針  等。添加不同的官能團進(jìn)一步增加了它們的多功能性，特別是當人們認為可以引入功能化時(shí)在 3' 端、5' 端或內部位置。新添加的官能團可以作為與各種生物分子進(jìn)行生物偶聯(lián)的手柄。然而，目前用于 DNA 生物偶聯(lián)的方法效率低下。該程序必須能夠耐受水性條件，產(chǎn)生高產(chǎn)率，并且由此產(chǎn)生的連接必須在生物條件下穩定。這是點(diǎn)擊化學(xué)的理想情況。

利用 HDC 反應，Seo 等人。能夠將熒光團標記到單鏈 DNA 的 5' 末端 。寡核苷酸經(jīng)過(guò)多次反應修飾，在其 5' 端顯示末端炔烴，熒光團包含疊氮基官能團。獲得了 91% 的產(chǎn)物收率，但在反應中沒(méi)有使用催化劑，導致 1,4-取代和 1,5-取代的 1,2,3-三唑產(chǎn)物的混合物。如果使用銅催化劑，則很可能僅產(chǎn)生 1,4-取代的三唑，并且反應進(jìn)行得更快。西拉等人。將 DNA 標記更進(jìn)一步，合成了核苷，每個(gè)核苷的芳香核堿基上都含有一個(gè)末端炔烴。修飾的脫氧腺苷 (dA)、脫氧鳥(niǎo)苷 (dG)、脫氧胞苷 (dC) 和脫氧胸苷 (dT) 均包括在內。使用固相合成，隨后合成了幾種寡核苷酸，其中含有一種修飾的核苷、兩種或根本不含（作為對照）。寡核苷酸及其雙鏈體的特性不受修飾的核苷的顯著(zhù)影響，與對照相比時(shí)相似的解鏈溫度證明了這一點(diǎn)。然后通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)將含有疊氮基官能團的報告分子與修飾的堿基綴合。結合后，報告分子開(kāi)始發(fā)出熒光，表明寡核苷酸已被成功標記。如果商業(yè)化，Seela 的修飾核苷可以使寡核苷酸標記變得微不足道。

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