脾臟處理

1.將兩個(gè)已解剖分離的脾臟，置于一個(gè)15 mL離心管頂部配備的70 μm細胞篩網(wǎng)上。使用無(wú)菌注射器的柱塞，以溫和力度將脾組織壓碎以通過(guò)細胞篩網(wǎng)進(jìn)行勻漿處理，確保不破壞細胞結構。在整個(gè)過(guò)程中，分次使用總計6 -10mL的含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培養基，逐步?jīng)_洗篩網(wǎng)以收集細胞。2.將收集到的細胞懸液以500 × g離心5分鐘，隨后，小心地去除上清液，并將細胞沉淀重懸于5 mL的紅細胞裂解緩沖液中，在室溫下靜置孵育5分鐘。孵育結束后，迅速加入10 mL磷酸鹽緩沖溶液（PBS）以終止紅裂過(guò)程，再次以500 × g離心5分鐘。若沉淀中仍有殘留紅細胞，需重復上述裂解和洗滌步驟，直至肉眼所見(jiàn)無(wú)紅色。3.細胞計數與活力檢測：完成裂解后，以500 × g離心5分鐘，丟棄上清液，然后將細胞沉淀用1 mL PBS重新懸浮。接下來(lái)，采用臺盼藍排除法鑒別活細胞，在血細胞計數板上進(jìn)行精確的細胞計數，以確定活細胞的數量。這種方法基于臺盼藍無(wú)法穿透活細胞膜而能夠染色死細胞的原理，從而區分出活細胞和死細胞的比例及總數。4. 通過(guò)流式檢測抗體標記的脾臟細胞。尤其需要注意一點(diǎn)，對于脾臟巨噬細胞的流式檢測，在抗體標記前，需要Fc受體的封閉，避免非特異染色。5. 大家拿到自己的流式結果后，如果實(shí)驗結果不符合自己的預期。這時(shí)最需要做的就是質(zhì)控自己的流式數據，比如細胞的分群，大概比例，細胞的死活，細胞的數量，分群是不是集中，一定要找文獻，無(wú)論如何，對照組的正常小鼠，這個(gè)數據是可以參考的。如果自己的流式數據對著(zhù)文獻都不太符合常規，就不要給給實(shí)驗下結論。這時(shí)，基礎的實(shí)驗體系就有問(wèn)題。

6. 對于巨噬細胞，CD11b和F4/80雙標，肝臟和脾臟，還有腹腔，肯定會(huì )有三群（根據這兩個(gè)maker的表達高低）。對于很多用荷蘭liposoma品牌的巨噬細胞清除劑clodronateliposomes氯膦酸二鈉脂質(zhì)體的客戶(hù)來(lái)說(shuō)，清除組和對照組，也可以參考這個(gè)圖。